謝曉亮:如何從康複者血漿的海量抗體中快速找到新冠“殺器”
2020年04月05日12:27

原標題:謝曉亮:如何從康複者血漿的海量抗體中快速找到新冠“殺器”

編者按:對於新冠肺炎而言,血漿療法雖好,但存在因人而異的風險,且不可能大規模使用。康複患者血漿中的關鍵成分,是具有大“鉗子”的中和抗體,能捕捉並改變病毒。作為大分子藥物,中和抗體特異性高,副作用小。

然而,血漿中的抗體不計其數,種類約有10的7~8次方之多。面對突如其來的疫情,如何快速“大海撈針”?

4月2日,北京大學李兆基講席教授、生物醫學前沿創新中心主任、北京未來基因診斷高精尖創新中心主任謝曉亮在科學公益組織未來論壇發起的第四期“《理解未來》科學講座:病毒與人類健康-專題科普”上分享了尋找新冠中和抗體的故事。

利用新型的單細胞基因組學技術,科學家們合作從70個康複期病人血漿中分離出30萬個與病毒針鋒相對的B細胞,並從中鎖定300個產生中和抗體的關鍵基因密碼。

謝曉亮介紹道,根據這些序列已經生產出300個抗體蛋白,正在測試。後續的動物實驗已在籌劃中,臨床實驗是下一步。

謝曉亮的演講全文由中科院生物物理所博士生李敏、郭麗潔整理。澎湃新聞經授權後二次整理、發佈。

謝曉亮:單細胞基因組學迎戰新冠肺炎

首先,我想借此機會,衷心感謝英雄的武漢人民,向一線的醫護工作者們致以崇高的敬意。我有兩個朋友也加入了援鄂醫療隊,我非常敬佩他們。

今晚的科普講座,我想跟大家分享的是,作為後方的科學工作者,我們如何通過單細胞基因組學迎戰新冠肺炎。

新冠肺炎席捲全球,控製疫情涉及四個方面:檢測、隔離、預防和治療。根據過去幾個月國內外疫情的發展,大家應該已經充分意識到了檢測和隔離的重要性,我今天的演講主要涉及預防和治療。

談到預防,人們紛紛把希望寄託在疫苗上。眼下全世界很多科學家正在研製疫苗,估計要年底才能出來。在疫苗出來之前,除了隔離,我們還能做什麼呢?世界急需的是強有效的治療方法,來降低死亡率,但是目前還沒有特效藥。

從上週中歐抗疫交流會上和前幾天的臨床結果,我們瞭解到,小分子藥物氯奎和羥氯奎在輕症患者上有一定效果,現在美國也開始使用了。小分子藥物,也就是化學合成藥物,一般研製週期很長,比如說十年。所以目前都是舊藥新用,藥效有限。

除小分子藥物外,血漿療法也初見成效。血漿療法就是把康複期病人的血漿離心,取上層清澈的血漿部分注射給病人。這是一種傳統療法,現在在美國等國家也開始使用。

血漿療法雖好,但有一定風險,因為血漿因人而異,是一個複雜的混合物;而且血漿來源有限,不可能大規模使用。

康複期病人的血漿中的關鍵成份是免疫系統產生的某種抗體。抗體是一種蛋白質,它的分子量是氫原子的15萬倍。所有抗體都有Y字形狀的結構,像兩把“鉗子”,用來捕捉抗原。那對我們來說,抗原就是新冠病毒。

新冠病毒是一種RNA 病毒,它的外殼上有刺突狀的S蛋白。S蛋白上面的紅色的部分是冠狀病毒的受體結合域(Receptor Binding Domain, RBD)。

新冠病毒入侵細胞時,S蛋白與人體細胞的表面受體ACE2結合,隨後病毒被內化,進入細胞,在細胞內被轉錄酶複製,重新組裝成大量新的病毒,又去繼續感染其他細胞。

抗體有很多種,我們關心的是中和抗體。中和的意思就像酸來了,我們用堿來中和;病毒來了,細胞用抗體來中和。中和抗體的作用是牢牢地結合到病毒上,改變它的功能,阻止它侵入細胞。我們的目標是快速找到並製備高純度中和抗體,作為藥物,代替血漿給病人注射。

抗體藥物是一種大分子藥物,與小分子藥物相比,它的特異性好,副作用小,近年來有不少成功的例子。

愛滋病原來是不治之症,2018年以後美國FDA批準HIV的抗體藥物,與其他抗病毒逆轉錄的藥物聯合使用。

針對伊波拉病毒,三種單複製抗體已獲美國FDA批準,目前正在臨床開發中。2015年,由軍事醫學科學院研發的抗體藥物MIL77成功治癒1名確診伊波拉病毒的感染者。

還有中東呼吸綜合徵(MERS), 2018年經過基因改造的牛生產的針對MERS病毒的人類抗體,在一期臨床試驗中表現良好。二期臨床因為疫情消失無法繼續。

以上這三種抗體藥物都是中和抗體。但問題是找到這些抗體的時間太長。採用的是單細胞複製放大的方法,需要幾個月。我們現在被逼著縮短這個時間。

我這裏順便提一下癌症。截止2018年,全球將近500個抗體新藥進入臨床試驗。它們不是中和抗體,而是與T細胞有關的抗體。其中以PD-1/PD-L1為靶點的抗體是研究熱點。

回到我們的課題:如何快速找到並製備高純度的中和抗體?

血漿中的抗體不計其數,種類約有10的7~8次方之多。想在血漿中直接找到新冠病毒的中和抗體,猶如大海撈針,目前無法實現。反正我不知道怎麼做。

我們需要走另外一個途徑,那就是先找到產生抗體的細胞。離心後血漿下面的這層是白細胞,其中包括人體內兩大免疫細胞,T細胞和B細胞。我們今天只講B細胞。

B細胞是生產抗體的,它產生於骨髓,通過血液和淋巴液分佈到全身的淋巴結。但是B細胞種類繁多,每個B細胞只生產某一種特定的抗體;而這種抗體是由B細胞的DNA序列決定的。所以我們採用的辦法就是通過對B細胞進行RNA測序來找到我們想要的中和抗體。

我們尋找新冠病毒中和抗體之路開始於大年初三,曹雲龍在幾個月前剛從哈佛拿到博士學位,他是我的哈佛實驗室里唯一一個跟我回國的。我們不是專門搞病毒或者免疫學的,單細胞基因組學是我們的專長。一開始我們只是想為抗疫做點什麼,當意識到單細胞基因組學也許有可能幫助找到中和抗體的時候,我們非常興奮,立馬開始讀文獻,製定實驗方案,四處尋找儀器和試劑。北大和北京市各單位的同事十分給力,所以很快就萬事俱備。

2月2號,我和我們中心的蘇曉東教授、測序平台負責人耿晨陽去了佑安醫院。在這裏見到金院長和馮處長,他們當即就同意合作,要提供康複期病人的血樣。緊接著醫院的粟斌和郭向華研究員來到我們中心,完成單細胞測序技術的培訓後就回到醫院的P2+實驗室,類似於P3實驗室,所以他們要穿很多防護服這樣的裝備。按理每天只應該工作5個小時,但他們經常工作8、9個小時,甚至11個小時。為此他倆還被隔離了整整兩個月。

在進一步解釋之前,我需要先給大家一些背景知識。

談到測序,大家知道這次疫情爆發後,中國科學家在一個月內就測出新冠病毒的完整序列,並在第一時間向全球公佈,為新冠肺炎的檢測奠定了基礎。相比之下2003年SARS爆發時,最早的序列用了5個月的時間才測出來,是由加拿大的團隊最先公佈的。

就在SARS發生的同一年,人類基因組計劃完成了,這是人類曆史上的一個裡程碑。當時一家美國的私人公司和美國組織的國際團隊激烈競爭。私人隊的隊長Craig Venter測的是他自己的基因組,而美國領導的國際團隊耗資30億美金,測的是6、7個人的組合;當時中國參與了1%的工作。

在人體細胞的細胞核里有 46 條染色體,23 條來自於父親,23條來自於母親,染色體的主要成分是遺傳物質DNA。大家知道,二十世紀最偉大的生物學發現是Waston和 Crick的DNA雙螺旋結構。DNA有四種堿基 A、T、C、G, A與 T 配對,C與G配對。簡單地說,堿基排列的序列決定了遺傳信息,也就是基因。人類基因組有60億對堿基,共有2萬多個基因,對應兩萬多個蛋白質。人與人相比,絕大部分的堿基都是相同的,只有千分之一堿基序列的差別決定了我們之間的不同。比如說這裏,這一個人體細胞里,來自父親和母親的DNA,他們的差別只是千分之一的堿基。

按照分子生物學的中心法則,DNA攜帶的遺傳信息,即基因序列,用來在轉錄過程中由轉錄酶產生信使RNA,接著在翻譯過程中由核糖體生成蛋白質。蛋白質是以氨基酸為基本單位的生物大分子,一共有二十種氨基酸,它們手拉手地接起來形成鏈狀大分子,然後再摺疊起來成為蛋白質,比如說Y字型的抗體蛋白。

蛋白質的合成遵循遺傳密碼。三個的DNA堿基決定一個氨基酸。所以DNA的序列和蛋白質的序列有一一對應的關係。比如說,抗體蛋白是B細胞里的抗體基因經過轉錄和翻譯的產物。

其實轉錄和翻譯並不一定要在人體內進行,有了基因序列,我們可以利用轉錄酶和核糖體在體外生產抗體蛋白。

17年過去了,生物基因檢測技術有了突飛猛進的發展。今天我實際上就是想講怎麼利用這新技術解決當下的問題。

2007年發生了新一代DNA測序儀的革命,使得測序價格的下降速度比半導體工業的指數衰減還快。現在只要1000美元,在一天之內就可以完成個人基因組的測序。新一代測序儀使得個體化醫療成為可能。也就是說通過個人基因組的信息來瞭解病因,為治療和預防疾病提供個性化方案。

人類基因組和新一代測序儀之後的另一個革命是單細胞基因組學。也就是說你給我一個單個的人體細胞,我就可以告訴你它整個的基因組。這是怎麼實現的呢?現在還沒有一種技術可以把一個細胞里的46根染色體每根從頭讀到尾,我們需要把單細胞里的微量DNA擴增,然後用新一代測序儀來測序。

大家可能聽說過PCR,是30 多年前的一個DNA放大技術,對生物學、醫學有很大貢獻,得了諾獎。PCR非常靈敏,在犯罪現場有一個DNA分子,PCR就可以把它放大,測出信號。但是PCR有很大偏差,有些基因被放大的倍數很高,有些很低。用它來放大整個的基因組,覆蓋率只有5%。

2012年我的哈佛實驗室發明了一種單細胞擴增技術叫MALBAC。它的名字很像紅酒MALBEC。它大大提高了單細胞基因組擴增的均勻度、覆蓋率和測序的精準度。後來我們又發明了一個更精準的擴增方法叫LIANTI,也是另外一個紅酒的名字。

那我們為什麼要做單細胞測序呢?我給大家舉一個實際應用的例子。我們團隊和北醫三院的喬傑團隊、北京大學的湯富酬團隊合作,把這個技術用到生殖醫學。在試管嬰兒的過程中篩選沒有遺傳缺陷的受精卵,以避免父母的遺傳疾病遺傳到下一代。這是2014年在北醫三院誕生的首個“MALBAC嬰兒”,一個非常漂亮的女嬰。我們去看她的時候,一聲都沒哭,還一個勁衝我笑。迄今為止,在國內也有多於一千對夫婦成功地避免了單基因遺傳疾病的後代傳遞。

單細胞的測序不僅可以是基因組,而且可以是轉錄組,也就是所有被表達的信使RNA的序列。我們中心的湯富酬教授十年前在英國做博士後的時候,首次用新一代測序儀測出了單細胞的轉錄組。轉錄組很重要,因為它決定了細胞的功能。一般來講,不同種類的體細胞,它們的基因組都一樣,但轉錄組不同,因此功能不同。

這是我們最近和富酬等同事一起合作的數據。每個點代表一個單細胞,點的位置不一樣,因為它們的轉錄組不一樣,表達量不一樣。同一種細胞型的細胞會形成一個點簇,我們用不同顏色標記不同細胞種類。單細胞轉錄組已經被廣泛用於細胞分型。

我們現在就是用這種單細胞轉錄的組實驗給康複期病人血液中成千上萬的B細胞分型。我們先把單個B細胞從血液里分離出來,然後測定每個細胞的轉錄組。同樣這裏每個點代表一個B細胞,不同的顏色代表不同的B細胞種類。

人們知道B細胞是由骨髓產生的,從造血幹細胞開始逐漸成熟,然後活化,最後變成漿細胞和記憶B細胞。這些不同的細胞種類我們都能看到。我們最關注的是記憶B細胞。

我剛說過,一般來講,在一個人身上,不同器官的細胞都有同樣的基因組和不同的轉錄組。但是B細胞在成熟過程中,它的基因組是可以被重組的。為了這個發現,日本科學家Tonegawa在1987年獲得了諾貝爾獎。在第14號染色體上,有VDJ三個區域。V區域有40個相似但不同的DNA序列,D有23個,J有6個序列。

當B細胞從不成熟到成熟狀態轉變的過程中,基因組開始重組,就像從V、D、J三套牌各抽出一張。這樣轉錄和翻譯產生的抗體就有很多種。有多少種呢?40x23x6 =5520種,但這還不是全部。因為這個14號染色體只是合成重鏈(藍色),而輕鏈(白色)是由在第2號或22號染色體上產生的。它們有 V和J,但是沒有D。除了VDJ重組,還有堿基的隨機突變,都加在一起使得最後DNA序列的種類達到10的7~8次方種,為免疫系統提供了多樣性。

抗體是用Y字型結構上的兩把“鉗子”,來捕捉抗原。這鉗子嘴的形狀以及與抗原結合的強度,取決於它氨基酸的序列。這裏我要強調,我們特別需要單細胞的測序技術,因為每個B細胞通過V(D)J重組只產生某個特定的抗體蛋白。

神奇的是,這10的7-8種次方產生不同抗體的B細胞,在抗原還沒有來的時候,已經在血液和淋巴液里產生了。而當某一種抗原到來後,與它結合的抗體是怎麼被發現和富集的呢?

在B細胞在未成熟到成熟的過程中,這些抗體分子IgM被放在細胞的表面作為B細胞的受體(B-cell Receptor, BCR)。這些細胞一直不分裂,直到某個抗原,比如S蛋白,結合到BCR上,給這個B細胞一個信號,它就被激活了,開始細胞分裂,1變2,2變4,這種B細胞就被富集了。

然後被富集的B細胞演化成漿細胞和記憶B細胞。漿細胞分泌IgG抗體到血液和淋巴結。而記憶B細胞留在骨髓和淋巴結很長一段時間。

因為記憶B細胞表面覆蓋著BCR也就是細胞受體。我們可以用新冠抗原把記憶B細胞從康複病人的血里分離,出來測序。

記憶B細胞的IgG抗體和漿細胞分泌的IgG抗體,接受同樣的抗原,因為它們兩對鉗子的可變區的序列和結構都是一樣的,只是在這固定區序列和結構不同,因為它們用的是C區域序列,而不是V(D)J。

讓我們看IgM和IgG抗體隨著時間的變化,第一次感染後,3天內出現IgM抗體,量不是太大,保留時間不長。

順便說一下,鍾南山院士的團隊的抗體檢測就是檢測IgM抗體。這方法很簡單,只用手指上取一滴血就可以了。但是感染後必須要等幾天才能知道。

我們想找的IgG一兩個星期以後才出來。持續3、4周,之後會減少。所以我們需要回訪的出院病人需要在這個時間段,如果康複時間太久了,IgG的量會越來越少。人類的免疫系統可以保證,如果第二次感染再發生的時候,免疫反應可以產生大量的IgG。

好,原理是這樣的,實驗怎麼樣?這是雲龍和文潔,孫文潔是我們中心的生物信息專家,他們拿到的一號病人數據。

這裏的六個記憶B細胞,它們的重鏈和輕鏈都有同樣的V(D)J序列,他們來自同一個母細胞,也有隨機的點突變。我們的假設是擁有同一種V(D)J序列的細胞數目越多,該細胞越有可能有好的免疫功能。這成為我們的第一篩選標準。這個選擇標準在傳統的單細胞複製方法里,難以實現。因為我們有高通量的單細胞測序,就可以利用這個假設來高效得篩選。

另外我們拿到這個V(D)J序列,就可以在體外生產這個抗體。利用這個生物學的中心法則,我們可以交給一個公司來做。

用這種方法我們找到了一些與S蛋白有很強結合力的抗體,也找到了幾個中和抗體。但是這種方法的效率還是不夠高,因為抗體的種類還是太多了。

後來我以前哈佛的博士生張旭加入了我們。她把小磁珠跟S蛋白或RBD連接起來,用這塊磁鐵把能和S蛋白或RBD結合的記憶B細胞從血液中分離出來。這樣一來效率就大大提高了。

找到抗體後我們首先就測它的結合強度。抗體與S蛋白結合強弱是以結合常數來衡量的。(左圖)橫軸代表抗體在溶液中的濃度,豎軸代表與S蛋白的結合程度。抗體的濃度越高,結合程度就越高。當結合程度達到50%,抗體的濃度就是它與S蛋白的結合常數,這個抗體是40pM。這個數越低,表明結合強度越高。雖然聽起來抽像,但這40pM對應每升血液里只需要打入6毫克抗體,當然是越低越好。

中和抗體需與ACE2競爭。根據近來文獻報導,ACE2與S蛋白結合常數是35nM(右圖),比抗體與S蛋白的結合常數高得多,所以結合強度低得多。

但我想強調,抗體結合力強不一定有中和能力,還要看結合的是不是S蛋白上關鍵部位。所以我們必須要做病毒的中和實驗。

鄭英慧是我們實驗室做中和實驗的能手。我們先做的是假病毒實驗,因為不需要P3實驗室。這個橫軸還是中和抗體的濃度。當抗體濃度特別高的時候,在細胞培養液里的病毒與抗體結合,而不進入細胞,當抗體濃度低的時候可以看到它進去,病毒進入細胞通過螢光指示。當抑製強度達到50%的時候抗體的濃度被稱作半抑製濃度,對於這個抗體我們當時看到的是50pM,是0.008微克/毫升,這是模擬病毒在人的細胞體外實驗。下一步就是到P3實驗室看真的病毒被抗體抑製的情況。

這是最近從P3實驗室得到的數據,讓我們非常高興。這3個抗體的半抑製濃度都小於1μg/mL,(1-10nM)。這個實驗主要是看細胞的死亡。左圖中,抗體濃度較低時,細胞受感染而凋亡。右圖中,在中和高抗體濃度的時候,病毒感染被有效抑製。

總結一下,我們已經從70個康複期病人血漿里的三十萬個B細胞中,篩選出300個富集度最高的Ig G抗體序列。

根據這些序列已經生產出300個抗體蛋白,正在測試,目前已篩出一大批高結合強度的抗體(Kd=10 pM-10nM)和多個有出色中和活性的抗體。

高通量單細胞轉錄組和VDJ測序,可直接檢測B細胞的富集程度,使得我們可以快速精準地篩選出大量優質的中和抗體。

後續的動物實驗已在籌劃中,臨床實驗是下一步。

篩選出的中和抗體有兩個應用。一是可以用於新冠肺炎的中和抗體治療,更安全且針對性強。

二是用於短期預防,保護我們的醫護人員和病人家屬,有效期大概3周,經過抗體改造有可能延長至3個月。

國內另外幾個團隊也一直在尋找中和抗體。我們的目標都是一致的,希望找到最好的抗體,儘早成藥!

我們的工作為將來可能出現的疫情做好了準備。用我們的新方法,對病毒有良好中和活性的抗體應該在十天之內就可以找到。

最後我想說,去年八月,在中美貿易戰, 以及我與美國科學家的合作受阻的背景下,我在Cell雜誌發表了這篇文章《Disease Has No Borders, Neither Should Research》。果然如此,這次疫情使人們自覺或不自覺地認識到,病毒確實沒有國界,抗疫也應如此!目前中國住院的病人已經越來越少,我們的臨床試驗也將要在疫情更為嚴峻的地方來進行。如果成藥,我們不會命名它為“中國抗體”,因為它的使用應該是沒有國界的。

今晚我之所以能在這裏跟大家分享,是因為我身邊這些並肩作戰的夥伴,我的團隊,還有合作者,很多都是疫情之後認識的。我也非常感謝北京市政府、北京市教委的大力支持和北京市科委的協調幫助!

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